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多聚磷酸酶調(diào)控肌肉蛋白質(zhì)凝膠特性的研究
多聚磷酸鹽是肉制品加工中常用的添加劑,它們可以改變肌肉的離子強(qiáng)度和pH,可以與蛋白的相互作用,解離肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物,多聚磷酸批發(fā)廠家增加蛋白質(zhì)表面的凈電荷數(shù),改善肉或肉制品的保水性、嫩度和適口性。然而添加到肉中的多聚磷酸鹽會(huì)在肉中多聚磷酸酶的作用下不斷水解,其中焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽主要通過焦磷酸酶(PPase)和三聚磷酸酶(TPPase)降解。本研究以豬背最長(zhǎng)肌為實(shí)驗(yàn)材料,首先,分離純化PPase和TPPase并其酶學(xué)特性進(jìn)行研究。其次,利用免試劑離子色譜技術(shù)觀測(cè)焦磷酸鈉(TSPP)、三聚磷酸鈉(STPP)及其復(fù)合物在純化后PPase或/和TPPase的作用下多聚磷酸鹽的量變和分子形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。最后,研究TSPP, STPP和磷酸鹽混合物在不同水解時(shí)段對(duì)肌肉勻漿物溶解性、流變特性和凝膠特性的影響。具體研究結(jié)果如下： 1焦磷酸酶的分離純化與酶學(xué)特性研究 通過超速離心、硫酸銨分級(jí)沉淀和陰離子交換層析,從豬背最長(zhǎng)肌中分離純化出PPase。PPase在非變性電泳和變性電泳圖譜上均呈現(xiàn)單一蛋白條帶。PPase活性為0.43μmol·mg-1 protein·min-1,純化倍數(shù)30.7,酶活回收率8%。PPase的底物專一性很強(qiáng)。但在反應(yīng)體系內(nèi)底物(TSPP)濃度超過3 mmolL-1時(shí),將會(huì)抑PPase的活性。PPase最適反應(yīng)溫度和pH值分別為50℃和7.5。Mg2+是PPase必需金屬離子,在4.75 mmol·L-1濃度時(shí),對(duì)酶激活作用最強(qiáng)。Ca2+卻酶的活性,NaCl和KCl均會(huì)酶的活性,NaCl的效應(yīng)強(qiáng)于KCl。EDTA-Na2和EDTA-Na4在高濃度時(shí)對(duì)酶活有較強(qiáng)的作用。1mmol·L-1NaF可以完全酶的活性。PPase水解TSPP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為0.36mmol·L-1PP, Vmax為0.086μmolPi·mg-1 protein·min-1。 2三聚磷酸酶的分離純化與酶學(xué)特性研究 通過超速離心、分級(jí)沉淀和DEAE-52交換層析,從豬背最長(zhǎng)肌中分離純化出TPPase。證實(shí)三聚磷酸酶是肌球蛋白。TPPase純化倍數(shù)4.12,回收率5.65%。TPPase的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為40℃和6.0,Mg2+、Ca2+對(duì)TPPase均有激活作用,分別在0.5 mmolL-1和2.0 mmol·L-1濃度時(shí)使酶活達(dá)到最大。PP是TPPase的競(jìng)爭(zhēng)性劑,PP添加濃度達(dá)到4 mol·-1時(shí),相對(duì)酶活僅剩7.88%。鹽離子NaCl和KCl對(duì)純化后肌球蛋白TPPase均有作用,KCl的效應(yīng)強(qiáng)于NaCl。EDTA-Na2和KIO3對(duì)酶活均有作用,Mg2+可以解除EDTA-Na2的效用。TPPase水解TPP的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax為0.049μmol Pi·mg-1 protein·min-1, Km為0.37mmol·L-1TPP。 3多聚磷酸鹽在純化酶系統(tǒng)中水解的定量分析 利用免試劑離子色譜法測(cè)定多聚磷酸鹽在純化酶系統(tǒng)中水解變化。PP在PPase的作用下直接被水解成正磷酸鹽(Pi),50min水解完畢。STPP水解分為兩步,首先被水解PP和Pi,其次生成的PP被進(jìn)一步水解成Pi。STPP在單一STPPase作用下水解非常緩慢,30 h僅有0.0376g·L-1STPP被水解,派生的TSPP的量一直在增加。而在PPase和STPPase共同作用下,水解過程中派生的TSPP會(huì)被迅速水解,沒有任何積累,STPP在30h可以完全水解。信息來源：www.0710house.com | 發(fā)布時(shí)間：2021年06月15日
在TPPase作用下STPP和TSPP共存時(shí),STPP水解更加緩慢,30 h僅有0.0111g·L-1 STPP被水解,TSPP在此水解期間不僅沒有下降還上升了0.0065 g·L-1。TPPase和PPase共同作用于STPP、TSPP和HMP的混合物時(shí)(TSPP/STPP/HMP=1:1:1), STPP水解速率慢于TPPase和PPase共同作用STPP時(shí)。HMP水解比較緩慢,30 h還有大量未水解。研究證實(shí)肌球蛋白幾乎沒有焦磷酸酶活性,多聚磷酸鹽以混合形式添加時(shí)其各組分總體水解速率會(huì)變慢,主要原因是TSPP會(huì)STPP水解。 4多聚磷酸鹽水解對(duì)豬肉勻漿物流變特性和凝膠特性的影響 TSPP、STPP、磷酸鹽混合物A (TSPP/STPP/HMP=2:5:2)和磷酸鹽混合物B(TSPP/STPP/HMP= 5:2:2)的添加可以提高肌肉勻漿物蛋白質(zhì)溶解度,降低蛋白濁度。多聚磷酸鹽的添加可以有效提高肌肉蛋白凝膠過程中最終貯能模量G'值。多聚磷酸酶劑EDTA-Na2的添加能延緩TSPP和STPP的水解,從而提高肌肉蛋白質(zhì)凝膠強(qiáng)度和凝膠保水性。單獨(dú)添加0.1%的TSPP或STPP時(shí),肌肉凝膠的保水性在24 h時(shí)會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì),而等量混合磷酸鹽添加后在24 h時(shí)的凝膠保水性不會(huì)下降。說明磷酸鹽以混合的形式添加凝膠的保水性比較好,且穩(wěn)定性比較好,其中磷酸鹽混合物B保水性好。多聚磷酸鹽對(duì)凝膠強(qiáng)度影響的主次順序是：磷酸鹽混合物A STPPTSPP磷酸鹽混合物B。多聚磷酸鹽的添加對(duì)凝膠彈性影響不大。
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